Étude de la fonction du réticulum sarcoplasmique pendant le couplage excitation-contraction du muscle squelettique à l’aide de biocapteurs fluorescents

Description

Le couplage excitation-contraction (EC) dans le muscle squelettique correspond à la séquence d’événements par laquelle la contraction de la fibre musculaire est déclenchée en réponse à l’activité électrique de la membrane plasmique. Le couplage CE a lieu au niveau des triades ; il s’agit de domaines nanoscopiques dans lesquels les invaginations transversales (t-tubules) de la membrane de surface sont en étroite apposition avec deux cisternes terminales adjacentes de la membrane du réticulum sarcoplasmique (RS). Plus précisément, le couplage CE commence par des potentiels d’action déclenchés au niveau de la plaque terminale, qui se propagent dans la membrane de surface et en profondeur dans la fibre musculaire à travers le réseau de tubules en t. Lorsqu’ils atteignent la région triadique, les potentiels d’action activent la protéine de détection de tension Cav1.1. À son tour, Cav1.1 ouvre directement le récepteur de la ryanodine de type 1 (RYR1) dans la membrane SR immédiatement adjacente, par un couplage conformationnel intermoléculaire. Cela déclenche la libération de Ca2+ dans la SR, médiée par RYR1, qui produit une augmentation du Ca2+ cytosolique et déclenche la contraction.

La compréhension actuelle des mécanismes impliqués dans le contrôle et la régulation de la fonction des canaux RYR1 est encore limitée. L’une des raisons est liée au fait que la détection de l’activité des canaux RYR1 dans les fibres musculaires intactes n’est possible qu’avec des méthodes indirectes. En outre, la question de savoir si le voltage de la membrane SR subit des changements au cours de l’activité musculaire n’a jusqu’à présent jamais été évaluée expérimentalement. Pourtant, une connaissance plus approfondie de ces processus est essentielle pour notre compréhension de la fonction musculaire dans des conditions normales et pathologiques.

Dans ce contexte, l’objectif général de mon projet de thèse était de concevoir et d’utiliser des biocapteurs à protéines fluorescentes spécifiquement localisés à la membrane SR des fibres musculaires différenciées, en les fusionnant à une séquence de ciblage appropriée. Grâce à une combinaison de techniques de physiologie et de biophysique de la cellule unique basées sur l’électrophysiologie et la détection de la fluorescence des biocapteurs, nous avons pu étudier l’activité du SR pendant le fonctionnement de la fibre musculaire. Plus précisément, mon travail de doctorat s’est concentré sur deux questions majeures : Le voltage de la membrane SR et la signalisation calcique SR pendant le couplage EC.

Le premier objectif de mon travail était de caractériser les changements de tension de la membrane SR pendant l’activité de la fibre musculaire. Pour ce faire, nous avons utilisé des biocapteurs FRET sensibles au voltage de la famille Mermaid. Les résultats montrent que le voltage trans-membranaire du SR ne subit pas de changement substantiel pendant le couplage EC. Ceci fournit la première preuve expérimentale, dans des conditions physiologiques, de l’existence de contre-flux ioniques qui équilibrent le déficit de charge associé à la libération de Ca2+ dans le SR médiée par RYR1. En effet, ce processus est essentiel pour maintenir le flux de Ca2+ SR lors de l’ouverture des canaux RYR1 et est donc d’une importance critique pour l’efficacité du couplage EC.

Le deuxième objectif de mon travail était de détecter les changements de concentration de Ca2+ se produisant dans le voisinage immédiat des canaux de libération de Ca2+ RYR1 lors de l’activation des fibres musculaires. Pour ce faire, nous avons tiré parti d’un membre de la récente génération de biocapteurs de Ca2+ codés génétiquement : GCaMP6f. Le biocapteur ciblant les SR fournit un accès unique à l’activité individuelle des populations de canaux RYR1 au sein de triades distinctes d’une même fibre musculaire. En plus de permettre une caractérisation détaillée des propriétés du biocapteur dans cette préparation, les résultats mettent en évidence l’uniformité remarquable de l’activation de la libération de Ca2+ par les SR d’une triade à l’autre, lors du couplage EC. Ces résultats ouvrent des perspectives stimulantes pour l’étude des pathologies associées à un comportement défectueux des canaux RYR1.